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三代測序


PacBio Sequel測序儀是Pacific BioSciences最新開發的基于單分子實時(SMRT)測序技術的最新第三代測序平臺,平均測序讀長可以達到15Kb,最長讀長可達40-60Kb。測序系統包含16個SMRT cell測序模塊,每個SMRT cell可產生5-10Gb數據。同時,SMRT技術無需擴增即可對單個DNA分子進行測序,有效避免了PCR擴增造成的GC偏好性,實現序列覆蓋的完整性和均一性。目前PacBio單分子實時測序技術也已廣泛應用于復雜基因組組裝和真核生物全長轉錄組測序。


基因組組裝


與現有二代短讀長測序技術相比,PacBio SMRT測序的長讀長可以有效解決基因組組裝難題,對于如簡單重復序列、回文序列、反向重復、轉座子等短讀長技術無法發現或不能定位的基因組復雜結構區域能夠很好的解決。PacBio SMRT長讀長測序技術結合BioNano單分子光學圖譜技術可進一步提高基因組從頭組裝效果,可以在較短時間內獲得測序物種的完整基因組草圖,拼接得到的contig和scaffold要遠大于基于二代測序拼接的結果。


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全長轉錄測序


基于二代高通量測序平臺的轉錄組測序(RNA-seq)憑借其高通量和低成本在過去的幾年中得到廣泛應用,然而讀長的限制使得其無法得到精確完整的轉錄本。

PacBio SMRT技術平均達15Kb的超長讀長可以檢測從5’末端到3’末端的完整轉錄本,實現無需拼裝的全長轉錄本分析,從而發現新基因、新可變剪切形式、基因融合事件以及反義轉錄本,為表達定量分析提供準確的組織特異性轉錄本集合,進行等位基因特異性表達分析,已成為復雜轉錄組研究的革命性技術。


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技術路線


基本流程圖1 (3).png

項目時間


中玉金標記從收到樣本到完成客戶所需的分析一般需要60天到120天不等,如果客戶需要訂制化服務則可能需要更長的時間。

經典案例


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復活草(Oropetium thomaeum) 是一種高度耐旱的禾本科植物,在遭受極端干旱后獲得水分可以再度生長。

Mockler研究組采用PacBio SMRT技術對復活草基因組進行了72X深度測序,組裝為625個contig,覆蓋了99%的基因組(245Mb中的244Mb),N50達到2.4Mb,組裝精度達到99.99995%,包括了端粒和著絲粒序列、長末端重復序列、反轉錄轉座子、串聯重復基因,和其他難于組裝的基因組元件。

研究人員進一步結合由200X的BioNano光學圖譜數據構建的基因組物理圖譜,將上述contig進一步組裝為scaffold,共得到46個主要scaffold覆蓋了94%的組裝結果,N50達7.8Mb,獲得了完整的基因組草圖。

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Doreen Ware研究組利用PacBio SMRT 全長轉錄組測序技術,對來源于玉米自交系B73的六種組織(根、花粉、胚、胚乳、幼穗和幼雄穗)進行轉錄組測序。

分析結果鑒定出111,151個獨特的可變剪切體,對應約27,000個基因,該數量幾乎是目前參考轉錄本數目的兩倍。

去除轉座子后,研究人員將剩余的可變剪切體和玉米參考基因組進行了比較,結果表明,3%的剪切體為來自新基因的新轉錄本,57%的剪切體是至少與參考基因組注釋基因共享一個剪切位點的新異構體。

通過與二代高通量測序數據比較發現,在PacBio數據中,平均86%的剪接點都有短讀長數據的支持。

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